The role of DcR3 in systemic lupus erythematosus and islet β-Cell viability and function

Le récepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des récepteurs aux facteurs de nécrose tumorale (TNF). Il est fortement exprimé dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un récepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. Étant une protéine soluble donc dépourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le récepteur DcR3 est incapable d’effectuer une transduction de signal intracellulaire à la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rôle de compétiteur pour ces derniers, afin d’inhiber la signalisation via leurs récepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos précédentes études, nous avons pu démontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protéger la viabilité des îlots de Langerhans. À la suite de ces résultats, nous avons généré des souris DcR3 transgéniques (Tg) en utilisant le promoteur du gène β-actine humaine afin d’étudier plus amplement la fonction de ce récepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement développé le syndrome lupus-like (SLE) seulement après l’âge de 6 mois. Ces souris présentent une variété d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont également manifesté des lésions rénales, cutanées, hépatiques et hématopoïétiques. Contrairement aux modèles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de réponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En péus, nous avons constaté que les cellules hématopoïétiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant l’homéostasie des cellules T pour interférer avec la tolérance périphérique, et ainsi induire l'autoimmunité. Chez l'humain, nous avons détecté dans le sérum de patients SLE des niveaux élevés de la protéine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont liés directement aux titres élevés d’IgE. Par conséquent, DcR3 peut représenter un facteur pathogénique important du SLE humain. L’étude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi d’élucider le mécanisme de protection des îlots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqué dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifié par ARN microarray quelques molécules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rôle dans le mécanisme d’action. Nous avons par la suite confirmé que Adcyap1 et Bank1 joue un rôle critique dans la protection des îlots de Langerhans médiée par DcR3. Notre étude a ainsi élucidé le lien qui existe entre la signalisation apoptotique médiée par Fas/FasL et la pathogénèse du SLE humain. Donc, malgré l’absence de mutations génétiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez l’humain. Ainsi, DcR3 peut simultanément interférer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phénotype plus complexe que les phénotypes résultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut également être utilisé comme paramètre diagnostique potentiel pour le SLE. Les découvertes du mécanisme de protection des îlots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger la greffe d'îlots.

Étude du dysfonctionnement du compartiment des cellules B chez des patients à différents stades d’infection par le virus d’immunodéficience humaine (VIH)

Les anomalies phénotypiques et fonctionnelles des lymphocytes B (LB) sont typiques d'une infection au VIH et se traduisent principalement par une activation polyclonale, une perte de la mémoire immunitaire ainsi qu'une réponse humorale déficiente et des phénomènes auto-immunitaires souvent précurseurs de lymphomes B. Ces anomalies se retrouvent principalement chez les patients lors de la phase chronique de la maladie et semblent être reliées en partie au niveau de la charge virale ainsi qu'à un compartiment de lymphocytes T CD4+ altéré. Cependant, quoique controversé, des éléments d’activation polyclonale ont également été observés chez les non-progresseurs à long terme (LTNPs) qui présentent une charge virale faible et un compartiment T CD4+ semblable aux individus séronégatifs. Ainsi, les objectifs principaux de cette étude sont 1) d’établir une chronologie des anomalies du compartiment des cellules B chez des individus infectés par le VIH qui ont une progression différente de la maladie (PHI normaux, rapides, sains et LTNP). 2) corréler les niveaux sériques du stimulateur de lymphocytes B (BLyS), un facteur de croissance des cellules B, avec les phénotypes observés chez ces mêmes patients. L’hyperglobulinémie, les niveaux sériques de BLyS et d’auto-anticorps ont été mesuré longitudinalement chez une cohorte d’individus en primo-infection (PHI) avec des progressions différentes de la maladie (rapides et normaux), LTNP et sujets sains. Nos résultats démontrent que l’activation polyclonale des LB survient indépendamment de la vitesse de progression et persiste chez les LTNP ou malgré une thérapie antirétrovirale efficace chez les progresseurs rapides. Des niveaux élevés de BLyS dans le sérum des progresseurs rapides corrèlent avec des fréquences altérées de monocytes et cellules dendritiques, suggérant un rôle de celles-ci dans l’atteinte du compartiment des cellules B.

Pathogenèse de l’hépatite autoimmune : influence des gènes, du sexe, de l’âge et de l’environnement

L’hépatite autoimmune (HAI) résulte d’une perte de tolérance du système immunitaire envers des antigènes de l’hépatocyte. Elle peut se présenter sous forme d’hépatite aiguë, parfois fulminante, ou comme une maladie chronique menant progressivement à une cirrhose hépatique. En absence de traitement, cette maladie est fatale. La pathogenèse de l’HAI et les mécanismes responsables de sa progression restent inconnus à ce jour. L’objectif global de ce projet est d’examiner les facteurs prédisposants et les mécanismes immunologiques responsables de l’apparition et de la progression de l’HAI. Pour permettre l’étude de la pathogenèse de l’HAI, nous avons développé un modèle murin expérimental d’hépatite autoimmune de type 2. Celui-ci est basé sur la xénoimmunisation de souris C57BL/6 avec les deux antigènes ciblés dans l’HAI de type 2 chez l’homme (CYP2D6 et FTCD). Par mimétisme moléculaire, le système immunitaire de ces souris réagit contre les protéines murines homologues et une HAI s’ensuit. Ce modèle expérimental présente la plupart des caractéristiques histologiques, biochimiques et sérologiques d’une HAI de type 2. Les souris développent une inflammation autoimmune chronique avec présence d’hépatite d’interface et d’infiltrations intralobulaires, un infiltrat composé majoritairement de lymphocytes T CD4+ mais aussi de lymphocytes T CD8+ et B, d’une élévation des ALT sériques, des niveaux d’immunoglobulines G circulantes augmentés ainsi que d’autoanticorps anti-LKM1 et anti-LC1. L’étude de l’influence du bagage génétique a permis de définir l’importance relative des gènes du CMH et des gènes non-CMH sur le développement d’une HAI. Les gènes du locus CMH sont essentiels mais insuffisants pour mener au développement d’une HAI et donc, la susceptibilité génétique à l’HAI est comme chez l’homme, multigénique. Les patients atteints d’HAI de type 2 sont généralement des jeunes filles. L’étude des influences de l’âge et du sexe dans ce modèle a permis de montrer que les souris femelles avant et au début de leur maturité sexuelle sont plus susceptibles au développement d’une HAI de type 2. De plus, les femelles ont un nombre réduit de lymphocytes T régulateurs, ce qui leur confère une susceptibilité accrue comparé aux mâles. L’ensemble de ces travaux nous a conduits à proposer un mécanisme où le développement d’une HAI chez les femelles d’un âge particulier résulterait de l’activation de cellules T CD4+ autoréactives ayant échappé aux mécanismes de tolérance centrale, via un mécanisme de mimétisme moléculaire avec un antigène exogène. En présence d’une tolérance périphérique réduite due à un faible nombre de cellules T régulatrices, les cellules T autoréactives proliféreraient et activeraient des cellules B autoréactives entraînant la sécrétion d’autoanticorps. L’activation subséquente de cellules T CD8+ cytotoxiques spécifiques amènerait la lyse des hépatocytes et la relâche d’autoantigènes permettant la perpétuation de l’autoimmunité.

Étude fonctionnelle et génétique d'une population de lymphocytes T CD4-CD8- impliquée dans la résistance au diabète auto-immun chez la souris

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes.

Prolongation de l’intervalle QT corrigé chez les adultes atteints de lupus érythémateux disséminé porteurs de l’anticorps anti-Ro/SSA

La prolongation de l’intervalle électrocardiographique QT est un facteur de risque d’arythmie ventriculaire et de mort subite. Cette anomalie, retrouvée chez certains patients atteints de lupus érythémateux disséminé, pourrait contribuer à la mortalité cardiovasculaire élevée dans cette population. L’anti-Ro/SSA, un auto-anticorps retrouvé chez environ 30% des patients atteints de lupus, est associé à la présence de blocs cardiaques chez le nouveau-né et pourrait aussi augmenter le risque de prolongation pathologique de l’intervalle QT chez l’adulte. Le présent mémoire est constitué de cinq chapitres traitant de l’association potentielle entre l’anticorps anti-Ro/SSA et la prolongation de l’intervalle QT. Le premier chapitre constitue une introduction permettant de mettre en contexte les éléments essentiels à la compréhension du projet d’étude. Le deuxième chapitre constitue une revue de l’état des connaissances actuelles sur le lien potentiel entre anti-Ro/SSA et intervalle QT. Le troisième chapitre présente le projet d’étude par l’intermédiaire d’un article publié dans Arthritis Care and Research. Dans cette étude, les patients de la cohorte de lupiques du Centre Universitaire de santé McGill ont subi des électrocardiogrammes dans l’objectif d’estimer l’association entre l’anti-Ro/SSA et les anomalies électrocardiographiques, en tenant compte d’autres facteurs démographiques et cliniques. L’association entre la prolongation de l’intervalle QT et la présence de l’anti-Ro/SSA a été démontrée (rapports de cotes ajustés de 5.1 à 12.6) et les patients porteurs de l’anti-Ro/SSA pourraient donc bénéficier de dépistage électrocardiographique systématique. Les points faibles et forts de cet article sont discutés dans le quatrième chapitre et des perspectives de recherches futures sont finalement abordées.

Assessing the Activity of Agonistic Autoantibodies in Systemic Sclerosis and their Effects on Cultured Vascular Smooth Muscle Cells

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dévastatrice d'étiologie inconnue. Le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose et la vasculopathie sont les trois principales caractéristiques de cette maladie. Une récente étude a révélé un nouveau lien entre l'auto-immunité et la fibrose, par la présence d'auto-anticorps stimulant le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) des fibroblastes. Ces auto-anticorps sont capables de stimuler les espèces réactives de l'oxygène et d’activer la kinase régulée par un signal extracellulaire (ERK1/2). L’hypothèse que nous formulons est que les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) exprimant conjointement les PDGFR, répondront elles aussi aux autoanticorps anti-PDGF-R. Le travail présenté ici vise à valider la présence d'auto-anticorps PDGFR dans les sérums de patients ScS, et à caractériser ensuite la réponse de VSMCs exposées à de l'immunoglobuline G (IgG) de ces sérums, en mesurant l’activation des cascades de signalisation spécifiques, ainsi que l'induction des gènes impliqués dans la réponse fibrotique. Nos résultats démontrent la présence d'une fraction IgG stimulant une réponse phénotypique dans les cultures de VSMCs. Notamment, d’importantes régulations positive et négative des gènes pro-fibrotiques tgfb1 et tgfb2 respectivement, ont été observées dans les VSMCs exposées à des fractions de ScS-IgG. Les fractions de IgG positives pour l'activation de ERK étaient présentes dans la plupart, mais pas dans tous les échantillons de SSc (68%, 19/28), et moins présentes dans les contrôles 27% (11/3). Bien que, les fractions de SSc-IgG ont pu considérablement immunoprécipiter le PDGFR, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique des récepteurs au PDGF (AG1296), n'a pas inhibé l'activation de ERK médiée par les fractions de SSc-IgG. Globalement, nos résultats indiquent la présence d'autoanticorps stimulants avec activité pro-fibrotique dans les sérums des patients ScS. Des travaux sont en cours pour identifier l'entité moléculaire responsable de la réponse d’IgG observée dans les cultures de VSMCs.

Importance of the HSP90 molecular chaperoning pathway for antibody diversification by determining AID stability

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.

Function of the immunoregulatory CD4-CD8- T cells in the context of autoimmune diabetes

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun.

Étude de l’impact de la grossesse sur l’hépatite auto-immune dans un modèle expérimental murin

L’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie chronique caractérisée par une destruction progressive du parenchyme hépatique par le système immunitaire. La majorité des patients atteints d’HAI sont des femmes (75% à 90% des cas). L’amélioration des traitements au cours des dernières années a permis à un grand nombre de ces femmes de devenir enceintes. Pendant la grossesse, une rémission spontanée de la maladie a pu être observée chez les femmes atteintes d’HAI. Cette rémission est temporaire et elle est généralement suivie d’une rechute suite à l’accouchement (post-partum). Les causes exactes de cette rémission associée à la grossesse et de la rechute post-partum ne sont pas connues à ce jour. Nous avons donc tenté de reproduire ces phénomènes dans un modèle murin d’HAI développé dans notre laboratoire, afin de déterminer les mécanismes possiblement impliqués. Notre modèle d’HAI consiste en une xéno-immunisation de souris C57BL/6 avec les auto-antigènes impliqués dans l’HAI de type 2 chez l’humain. Nous avons ainsi accouplées des souris préalablement xéno-immunisées, puis nous les avons sacrifiées au début de la 3e semaine de gestation ou 2 à 3 semaines post-partum, afin d’évaluer les dommages hépatiques et afin d’étudier la réponse immunitaire. Comme chez les femmes atteintes d’HAI, les souris présentent une rémission de la maladie pendant la grossesse. Nous en sommes venus à cette conclusion par l’observation d’une diminution de l’inflammation hépatique, des niveaux de transaminases sériques et des titres d’auto-anticorps circulants. À l’inverse des humains, les souris xéno-immunisées ne présentent pas de rechute post-partum. Une analyse des cellules régulatrices (cellules T régulatrices et cellules B productrices d'IL-10) suggère une implication des Tregs hépatiques dans la rémission, car ceux-ci sont augmentés pendant la gestation. Ces Tregs hépatiques sont majoritairement d’origine thymique et ne semblent pas particulièrement attirés au foie en réponse à l’inflammation. La polarisation TH2 est un phénomène connu pendant la grossesse, par contre elle ne semble pas influencer la réponse auto-immune dans nos souris. Une meilleure compréhension des mécanismes d’immunosuppression observés lors de la grossesse pourrait mener au développement d’une thérapie mieux ciblée.

Étude de protection conférée par vaccination ADN dans un modèle murin d’hépatite auto-immune

La vaccination ADN à l’aide de plasmides codant pour des autoantigènes s’est avérée efficace dans la protection contre plusieurs maladies auto-immunes. Le but de ce mémoire était dans un premier temps d’établir si un protocole de vaccination ADN composé de 3 injections de pCMV-CTLA-4-NP et de pVR-IL-12 à deux semaines d’intervalle avait un effet protecteur contre le développement d’une hépatite auto-immune chez la souris TTR-NP, un modèle murin transgénique de la maladie et précédemment développé au laboratoire. Dans un deuxième temps, le but était d’élucider, le cas échéant, les mécanismes sous-tendant la protection conférée par la vaccination ADN. Les hypothèses initiales étaient qu’une protection allait effectivement être conférée par la vaccination ADN et que celle-ci pouvait être attribuable à une déviation de la réponse typiquement Th1 de la maladie vers une réponse Th2, à un épuisement des cellules immunitaires et/ou à l’activation et à l’induction de prolifération de cellules régulatrices. Les résultats montrent que la vaccination ADN induit une protection transitoire contre le développement d’infiltrations lymphocytaires au foie. Cette protection se ferait via un épuisement des cellules CD4+, CD8+ et CD19+ se retrouvant à la rate et exprimant PD 1 dans une plus forte proportion à 3 mois, et ne serait médiée ni par les lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+FoxP3+, ni par les cellules CD8+FoxP3+. Une déviation de la réponse Th1 vers une réponse Th2 demeure une explication supplémentaire plausible à la protection conférée mais nécessiterait une caractérisation en situation plus physiologique avant de pouvoir inférer sur son implication réelle. La vaccination ADN n’influe ni sur la présence d’autoanticorps, ni sur les niveaux d’alanine aminotransférase, deux marqueurs de la maladie.

Rôle de la tolérance centrale et périphérique des lymphocytes T autoréactifs dans deux nouveaux modèles murins double transgéniques

Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays développés. L’autoimmunité résulte de la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire vis-à-vis des autoantigènes exprimés par les tissus de l’organisme, entraînant la destruction d’un ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. L’hépatite autoimmune et le diabète autoimmun se caractérisent par la destruction sélective des hépatocytes et des cellules beta pancréatiques, respectivement. De plus en plus d’arguments suggèrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le déclenchement, la progression et la régulation des réponses associées à plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi l’évolution de clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques à un antigène particulier dont le site d’expression différait. Pour ce faire, nous avons développé deux nouveaux modèles murins double transgéniques par croisement entre une lignée de souris exprimant un TCR transgénique spécifique à la nucléoprotéine (NP) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hépatocytes (modèle d’hépatite autoimmune), ou 2) simultanément dans le thymus et le pancréas (modèle de diabète autoimmun). L’avidité fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP chez les souris TCR transgéniques était inversement proportionnelle au niveau d’expression du TCR. Le répertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang périphérique a été caractérisé pour chacune des lignées de souris double transgéniques, de même que la capacité fonctionnelle et le phénotype (marqueurs d’activation/mémoire) des lymphocytes T CD8+ autoréactifs. Chacun des deux nouveaux modèles présentés dans cette étude ont montré que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP sont aptes à briser la tolérance centrale et périphérique et à provoquer une réaction d’autoimmunité spontanée. Dans le modèle d’hépatite autoimmune, où l’expression de l’autoantigène était restreinte au foie, la surexpression du TCR transgénique a entraîné une délétion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP prévenant le développement d’une hépatite spontanée. alors qu’un niveau de TCR comparable à celui d’une souris de type sauvage a permis une sélection positive des lymphocytes autoréactifs qui se sont accumulés dans le foie où ils se sont activés pour provoquer une hépatite autoimmune spontanée. Dans le modèle de diabète autoimmun, où l’autoantigène était exprimé dans le pancréas et le thymus, les souris des deux lignées double transgéniques ont montré une délétion thymique partielle, peu importe le niveau d’expression du TCR. Seuls les mâles adultes développaient un diabète spontané et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulière de marqueurs d’activation/mémoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire était absente chez les souris femelles et les mâles sains. L’étude de la tolérance des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans nos deux nouveaux modèles murins double transgéniques a permis d’identifier des mécanismes alternatifs possiblement impliqués dans la tolérance et l’activation, et de mieux comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans le processus autoimmun menant à l’hépatite autoimmune et au diabète autoimmun. Ces découvertes seront utiles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoréactifs.

Développement d’un nouveau modèle murin expérimental de sclérodermie

La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc.

Studies of MHC class I antigen presentation & the origins of the immunopeptidome

La présentation d'antigène par les molécules d'histocompatibilité majeure de classe I (CMHI) permet au système immunitaire adaptatif de détecter et éliminer les agents pathogènes intracellulaires et des cellules anormales. La surveillance immunitaire est effectuée par les lymphocytes T CD8 qui interagissent avec le répertoire de peptides associés au CMHI présentés à la surface de toutes cellules nucléées. Les principaux gènes humains de CMHI, HLA-A et HLA-B, sont très polymorphes et par conséquent montrent des différences dans la présentation des antigènes. Nous avons étudié les différences qualitatives et quantitatives dans l'expression et la liaison peptidique de plusieurs allotypes HLA. Utilisant la technique de cytométrie de flux quantitative nous avons établi une hiérarchie d'expression pour les quatre HLA-A, B allotypes enquête. Nos résultats sont compatibles avec une corrélation inverse entre l'expression allotypique et la diversité des peptides bien que d'autres études soient nécessaires pour consolider cette hypothèse. Les origines mondiales du répertoire de peptides associés au CMHI restent une question centrale à la fois fondamentalement et dans la recherche de cibles immunothérapeutiques. Utilisant des techniques protéogénomiques, nous avons identifié et analysé 25,172 peptides CMHI isolées à partir des lymphocytes B de 18 personnes qui exprime collectivement 27 allotypes HLA-A,B. Alors que 58% des gènes ont été la source de 1-64 peptides CMHI par gène, 42% des gènes ne sont pas représentés dans l'immunopeptidome. Dans l'ensemble, l’immunopeptidome présenté par 27 allotypes HLA-A,B ne couvrent que 17% des séquences exomiques exprimées dans les cellules des sujets. Nous avons identifié plusieurs caractéristiques des transcrits et des protéines qui améliorent la production des peptides CMHI. Avec ces données, nous avons construit un modèle de régression logistique qui prédit avec une grande précision si un gène de notre ensemble de données ou à partir d'ensembles de données indépendants génèrerait des peptides CMHI. Nos résultats montrent la sélection préférentielle des peptides CMHI à partir d'un répertoire limité de produits de gènes avec des caractéristiques distinctes. L'idée que le système immunitaire peut surveiller des peptides CMHI couvrant seulement une fraction du génome codant des protéines a des implications profondes dans l'auto-immunité et l'immunologie du cancer.